科研服务 > 第二代定序 > 植物降解组

 
植物 miRNAmRNA 完全或接近完全的配对结合后, 会引起目标基因在配对的第十位核酸上发生剪切,进行基因表达的调控。 伴随第二代定序的进步,利用 PARE* (Parallel Analysis of RNA Ends) 方法, 以降解组定序(Degradome Sequencing)测出剪切位点, 被剪切的 3’ 片段以 RNA 连接酶连接上 5’ adaptor 后, 经反转录形成双股 cDNA, 再以 EcoP 15I** 酵素切位接上 3’ adaptor 后往下进行定序分析。 目前此方法已成功应用于阿拉伯芥,水稻等植物的降解组定序上。
 
   
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  * German, M.A., Pillay, M., Jeong, D.H., Hetawal, A., Luo, S., Janardhanan, P., Kannan, V., Rymarquis, L.A., Nobuta, K., German, R. et al. (2008) Global identification of microRNA-target RNA pairs by parallel analysis of RNA ends. Nat Biotechnol, 26, 941-946.  
 
  **Addo-Quaye, C., Snyder, J.A., Park, Y.B., Li, Y.F., Sunkar, R. and Axtell, M.J. (2009) Sliced microRNA targets and precise loop-first processing of MIR319 hairpins revealed by analysis of the Physcomitrella patens degradome. RNA, 15, 2112-2121.  
 
   机型 / 软体
  • Illumina Genome Analyzer IIx
  • CleaveLand 分析软体*

    * Addo-Quaye, C., Miller, W. and Axtell, M.J. (2009) CleaveLand: a pipeline for using degradome data to find cleaved small RNA targets. Bioinformatics, 25, 130-131.

  •    报告范例
    CleaveLand 分析软体分析进行数据的处理, 第一步先扣除 structural RNAs 序列, 再与 cDNA 资料库进行比对, 选取条件相符的序列与 small RNAs 资料库进行互补性比对, 去除杂讯后,会得到 miRNA 结合到 mRNA 的位置, 再依所计算出的剪切位可靠性进行分类,由高至低依序为 Category 0 ~ 4 (Category 0 表示可靠性最高), 并以 T-plot 图示分析的结果。
    • 剪切点可靠性分群
    PC-5p-50747 miRNA 的目标基因 AT2G34480 为例, 其与 PC-5p-50747 配对结合后, 会在此基因的第 520 个碱基 Adenine (如表最下方的 * 处) 进行剪切。 将 Reads 分析整理后,依据剪切点的可靠性进行分群 (如下表)。
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    Category 分类的定义如下:
    Category 0 : 在目标基因中只有出现一个剪切位,且此位置在该基因的 Reads 数最高;
    Category 1 : 有一个以上的剪切位,且这些位置在该基因的 Reads 数皆最高;
    Category 2 : 判定的剪切点,Reads 数高于该基因的平均 Reads 数,
                            但其少于该基因 Reads 数最高的片段;
    Category 3 : 判定的剪切点,Reads 数少于该基因的平均 Reads 数;
    Category 4 : 判定的剪切点,但 Reads 数只为 1
    • T-plot
    X 轴为 AT2G34480 基因 cDNA 全长位置, Y 轴为经校正过后的 Reads 数, 红色 pick 为经软体判定为剪切点, 可由 t-plot 图观察是否具可靠性。
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